蛋白質含量測定

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蛋白質含量測定：檢測項目與方法的全面解析

蛋白質是生命活動的重要物質基礎，其含量測定在食品工業、生物醫學研究、臨床診斷和制藥等領域具有關鍵意義。本文介紹蛋白質含量測定的主要檢測項目、方法原理、操作流程及適用場景，為實際應用提供參考。

一、蛋白質含量測定的核心檢測項目

蛋白質含量測定的核心目標是準確、地檢測樣品中的總蛋白濃度，排除干擾物質的影響。檢測項目通常包括以下內容：

1. 總蛋白濃度測定：量化樣品中所有可溶性蛋白質的總量。
2. 純度評估：結合電泳或色譜法，分析目標蛋白與其他雜質的比例。
3. 干擾物檢測：評估樣品中可能影響檢測結果的物質（如核酸、脂類、去污劑等）。

二、常用檢測方法及其技術細節

1. 凱氏定氮法（Kjeldahl Method）

• 原理：通過高溫消解將蛋白質中的氮轉化為銨鹽，蒸餾后用酸吸收，滴定計算總氮含量，再乘以蛋白質換算系數（通常為6.25）。
• 步驟：
  1. 樣品消解（濃硫酸、催化劑）。
  2. 蒸餾釋放氨氣。
  3. 滴定計算氮含量。
• 優點：經典、準確，適用于食品和農產品檢測。
• 缺點：耗時（2-3小時）、無法區分蛋白氮與非蛋白氮。
• 適用場景：固態或高脂樣品（如肉類、谷物）。

2. BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）

• 原理：在堿性條件下，蛋白質將Cu²?還原為Cu?，后者與BCA試劑生成紫色絡合物，562 nm處測定吸光度。
• 步驟：
  1. 配制標準曲線（BSA標準液）。
  2. 加入BCA工作液，60℃孵育30分鐘。
  3. 比色測定。
• 優點：靈敏度高（0.5-2000 μg/mL）、抗干擾能力較強（可耐受1% SDS）。
• 缺點：受強還原劑（如DTT）影響。
• 適用場景：細胞裂解液、血清等復雜樣品。

3. Lowry法（Folin-酚試劑法）

• 原理：蛋白質與銅離子結合生成復合物，后者還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑，生成藍色產物，750 nm處檢測。
• 優點：靈敏度高于BCA法（1-100 μg/mL）。
• 缺點：步驟繁瑣、受去污劑（如Triton X-100）干擾。
• 適用場景：純化蛋白溶液的定量。

4. 紫外吸收法（UV Absorption）

• 原理：利用蛋白質中酪氨酸、色氨酸在280 nm處的吸收峰定量。
• 快速計算公式：濃度（mg/mL）= A280 / 消光系數。
• 優點：無需試劑、快速無損。
• 缺點：受核酸污染干擾（需用A260/A280比值校正）。
• 適用場景：純化后的單一樣本（如抗體溶液）。

5. Bradford法（考馬斯亮藍法）

• 原理：考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后由棕紅色變為藍色，595 nm處檢測。
• 優點：操作簡便（5分鐘出結果）、成本低。
• 缺點：易受堿性緩沖液和去污劑干擾。
• 適用場景：實驗室常規檢測（如酶提取液）。

三、方法選擇的關鍵因素

方法	靈敏度	檢測時間	干擾物敏感性	適用樣本類型
凱氏定氮法	低	長（小時級）	低	固體、高脂樣品
BCA法	高	中（30分鐘）	中度	復雜生物樣品
Lowry法	高	長（1小時）	高	純化蛋白
紫外吸收法	低	即時	高	無核酸污染的純化蛋白
Bradford法	中	快（5分鐘）	中度	一般溶液

四、質量控制與注意事項

1. 標準曲線校準：每次實驗需使用已知濃度的標準蛋白（如BSA）建立標準曲線。
2. 重復檢測：至少3次平行實驗以減少誤差。
3. 干擾物處理：
   • 核酸污染：用DNase/RNase消化或A260/A280校正。
   • 去污劑：稀釋樣品或選擇兼容性方法（如BCA法）。
4. 樣本預處理：復雜樣品需離心或過濾去除顆粒物。

五、新興技術與自動化檢測

1. 熒光染料法：基于SYPRO Orange等熒光探針，靈敏度達ng級。
2. 微流控芯片：集成化檢測，適用于微量樣本（μL級）。
3. 自動化分析儀：如Nanodrop（紫外法）和Qubit（熒光法），實現快速高通量檢測。

六、結論

蛋白質含量測定需根據樣本特性（如純度、干擾物種類）和實驗需求（靈敏度、速度）選擇合適方法。常規檢測推薦BCA法或Bradford法；高純度樣本可優先選擇紫外吸收法；復雜樣品需結合預處理和抗干擾能力強的技術。隨著技術的發展，自動化儀器和熒光法正逐步成為檢測的新趨勢。

參考文獻

• Smith, P.K. et al. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150(1), 76-85.
• Lowry, O.H. et al. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275.

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